スクリーニングなし

Nature Communications volume 14、記事番号: 5294 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

Saccharomyces cerevisiae は、アルコール発酵におけるこの生物の卓越性と、その代謝を操作するために利用できる一連の高度な遺伝子ツールにより、産業バイオテクノロジーの主力製品です。 しかし、S. cerevisiae は、毒性により高力価での生産が制限されるため、多くのバルクバイオ製品の過剰生産には適していません。 ここでは、ハイスループット アッセイを使用して、ナイロン前駆体である 20 g L-1 アジピン酸 (AA) に対する耐性について、公的にアクセス可能な 108 の酵母株をスクリーニングします。 我々は、15 種類の耐性酵母を同定し、AA の前駆体である cis,cis-ムコン酸 (CCM) の生産用に Pichia occidentalis を選択しました。 P. occidentalis 用のゲノム編集ツールキットを開発することにより、最大の力価 (38.8 g L-1)、収量 (グルコース 0.134 g g-1)、および生産性 (0.511 g L-1 h-1) を備えた CCM の流加生産を実証します。 ）これは、S. cerevisiae を使用して達成されたすべての指標を上回っています。 この研究は、AA の工業的な生物生産に私たちを近づけ、生物処理における宿主選択の重要性を強調します。

歴史的に、ビール酵母 (Saccharomyces cerevisiae) は、燃料、化学物質、および医薬品の過剰生産の好ましい微生物宿主でした。 しかし、多くのバルク化学物質やバイオ燃料は価値が低いため、商業規模の生産に必要な濃度は、出芽酵母や他のモデル生物にとって有毒であることがよくあります。 たとえば、S. cerevisiae は、低濃度から中濃度のブタノール (2%)1、バニリン (0.05%)2、ベンズアルデヒド (0.1 ～ 0.2%)3、および多くの有機酸 (0.25 ～ 2.5%) では増殖を維持できません。 4、5、6。 理想的な有機酸バイオプロセスは酸性 pH で実行されるため、有機酸はバイオプロセスに特有の課題をもたらします。これにより、下流での非解離形態の回収が簡素化され、発酵中の pH 維持の要件が回避されます。 ただし、解離していない酸 (pH < pKa) は細胞内に自由に拡散し、サイトゾル (pH 5 ～ 7) で解離するため、酸毒性は pH に反比例します7。 したがって、生成物の毒性を回避するために、S. cerevisiae および他の微生物のほとんどの有機酸生産菌株の培養は、pH > pKa8、9、10 で行われます。

アジピン酸は、ナイロン 6,6 の製造に使用される C6 ジカルボン酸です。 アジピン酸は年間生産量 300 万トン、世界市場 60 億米ドル 11 で、米国エネルギー省によって「スーパーコモディティ」に分類されています 12。 アジピン酸の世界的な需要は現在、シクロヘキサンと硝酸を含む化学プロセスによって満たされていますが、この方法では石油化学資源が利用され、強力な温室効果ガスである亜酸化窒素が発生するため、より持続可能な製造ルートの検討が求められています。 アジピン酸生合成の自然経路は存在しませんが、その生物生産のために少なくとも 8 つの人工生化学経路が提案されています 11。 これらの経路のうち、cis,cis-ムコン酸 (CCM) 経路を使用することで大きな進歩が達成されました。 この戦略では、シキミ酸経路の中間体である 3-デヒドロシキミ酸から CCM を合成するために、3 つの異種酵素、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、プロトカテク酸デカルボキシラーゼ、およびカテコー​​ル ジオキシゲナーゼを使用します。 CCM はエン酸レダクターゼ酵素による水素化を介してアジピン酸に変換されますが、これまでに特徴付けられている細菌変異体は酵母宿主内であまり機能せず 13、CCM からアジピン酸へのモル変換率は 0.9% 未満に達します 14。 適切な酵母活性エン酸レダクターゼが存在しない場合、S. cerevisiae は、最大 22.5 g L-1、0.1 g g-1 グルコース、および 0.21 g L-1 の力価、収量、生産性で CCM を合成するように操作されています。 h−1、それぞれ9、10。 これらの進歩にもかかわらず、酵母の CCM プロセスは、CCM の pKa (3.87) をはるかに上回る pH 5 ～ 6 で実行され、製品の毒性を制限するために酸を解離した形に維持します。

多くのバルクバイオ製品に対する S. cerevisiae の耐性が低いことに対応して、焦点は産業用途により適した表現型を求めて非従来型酵母種をスクリーニングすることに移ってきました 15。 菌株の選択はバイオプロセス開発において重要であり、見落とされがちな側面ですが、標的の最終生成物に合わせて調整された微生物宿主を選択することで、菌株操作の介入が減り、下流の分離が簡素化され、生成物の毒性が制限され、全体的なプロセス指標が改善される可能性が高いためです16。 例えば、ヤロウィア・リポリティカは脂肪酸とアルカンの生産に適した油脂性で浸透圧耐性のある宿主であり17、クルイベロミセス・マルシアヌスは急速に成長する耐熱性酵母であり18、ピキア・クドリャヴゼヴィは多様な微生物の生産に利用される強固な酸耐性宿主である。有機酸19． 約 1,500 種の酵母が 100 属以上に分類されており、公共培養リポジトリには数千の異なる酵母株が含まれています。 これらの酵母種の大部分は標準培地を使用して実験室で培養でき20、ゲノム配列決定、システム生物学、株工学の大きな進歩により、非従来型宿主の遺伝子家畜化にかかるコストと労力が劇的に削減されました。 Y.リポリティカ 21、K.マルシアヌス 18、および P.パストリス 22 を含む多様な酵母種用に洗練された遺伝的ツールキットが開発されており、サッカロミセスを超えた宿主選択の新たな機会を提供しています。