16S rRNA 遺伝子プライマーの選択は影響を与えます - 浙江ホットプロダクツ株式会社

Scientific Reports volume 13、記事番号: 12577 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

現在、16S rRNA アンプリコン配列決定、または最近ではメタトランスクリプトーム解析が、ヒトと細菌の DNA を主な比率で含むサンプルの微生物プロファイリングに推奨される唯一の方法です。しかし、ヒト DNA のオフターゲット増幅のため、現在のプロトコールは生体サンプルには不十分です。ここでは、ヒトの DNA 含有量が大半を占める臨床サンプルのバクテリオム分析のための、効率的で信頼性が高く、手頃な価格の方法を紹介します。私たちは、V4 領域をターゲットとする広く使用されている 515F-806R (V4) プライマー、68F-338R プライマー、および修正セットを使用した 16S rRNA アンプリコンシークエンシングを使用して、食道、胃、十二指腸の合計 40 件のヒト生検における微生物叢プロファイルを決定しました。 V1 ～ V2 領域をターゲットとする 68F-338R (V1-V2M) プライマー。 V4 プライマーを使用すると、平均 70% のアンプリコン配列変異体 (ASV) がヒトゲノムにマッピングされました。一方、V1-V2M プライマーを使用した場合、このオフターゲット増幅は見られませんでした。さらに、V1-V2M プライマーは、V4 プライマーと比較して、分類上の豊富さと分析の再現性が大幅に向上しました。 V1-V2M 16S rRNA シーケンス法は信頼性があり、コスト効率が高く、医学研究における細菌の豊富なヒトサンプルに適用できると結論付けています。

過去 10 年にわたり、培養に依存しないハイスループットシークエンシング手法を使用してヒトのバクテリオームを調査することは、人体のさまざまなニッチに生息する細菌群集を研究するために最も頻繁に使用される手法の 1 つになりました 1,2。第 3 世代技術へのアクセスと、ハイスループットシーケンスに関連するコストの削減により、アンプリコン 16S rRNA 遺伝子シーケンスから、便、ヒト膣 3、または綿棒などのサンプルにおける完全な 16S rRNA 遺伝子のシーケンスおよびメタゲノム / メタトランスクリプトームシーケンスへの移行が生じています。皮膚または口腔4には、ヒトと細菌の DNA が主な比率で含まれています。しかし、低濃度の細菌 DNA を含むサンプルや、血液、尿、ヒト生検サンプルなどの宿主 DNA によって「汚染された」サンプルでは、バクテリオームプロファイリングは依然として 16S rRNA 遺伝子配列決定に大きく依存しています。生成されるデータ量が比較的少ないため、複雑なバイオインフォマティクス分析5が必要なく、価格も手頃です。一方、16S rRNAアンプリコン配列決定の結果は、取得される情報の質および分類学的情報として、高度に保存された16S rRNA遺伝子配列全体に散在する9つの利用可能な可変領域からの超可変サブ領域の選択に大きく依存します。精度は、使用するプライマーセットによって大きく異なる可能性があります6。現在、大多数の研究は、アースマイクロバイオームプロジェクト (EMP)7 の広く採用されている標準化プロトコルのような V4 単一可変領域、またはヒトマイクロバイオームの二重インデックスプロトコルのような V1 ～ V38 または V3 ～ V59 可変領域のいずれかを対象としています。プロジェクト (HMP)。これは主に、広く使用されている Illumina シーケンスプラットフォームが短いシーケンス (NextSeq、MiniSeq、iSeq ≤ 300 塩基、および MiSeq ≤ 600 塩基) しか生成しないためです。残念ながら、最近の研究では、一般的に標的とされる 16S rRNA 遺伝子サブ領域 V4 が人体に一般的に存在する分類群を最も正確に評価していないことが繰り返し示されています 6、10、11。さらに、領域 V3 ～ V5 とともに、特に生検サンプルにおいて、ヒト DNA のオフターゲット増幅の影響を受けやすく 12、その結果、まれな分類群や細菌の分解能が失われる可能性があり、その結果、データのかなりの部分が無駄になります。

ここでは、食道、胃、十二指腸からの生検サンプルにおけるヒト DNA のオフターゲット増幅を大幅に減少させながら、α 多様性と分類学的性質を大幅に向上させる、V1-V2 16S rRNA 遺伝子サブ領域をターゲットとするプライマーセットを使用した新しいプロトコルを示します。 V4 領域をターゲットとする一般的に使用されるプライマーと比較した精度。シーケンスに必要な機能 (フローセルアダプターとインデックス) を含む V1 ～ V2 領域の増幅プライマーは、最大リード長 150 bp の Illumina MiniSeq プラットフォーム用に最適化されており、増幅プライマーの実行に関心のある研究室にとってコスト効率の高いオプションを提供します。ハイスループットの 16S rRNA 遺伝子配列決定。分類学的分類のパフォーマンスをさらに向上させるために、バイオインフォマティクスパイプラインへのペアエンドリードの連結を組み込みました 13。

0.5%) between the datasets from the esophagus and duodenum biopsies showed increased representation of the abundant genera Prevotella, Fusobacterium, and Streptococcus in the V4 dataset and Neisseria, Haemophilus and Rothia in the V1–V2M dataset (Fig. 6). In biopsies from the stomach, we observed increased representation of abundant genera Prevotella and Fusobacterium only in the V4 dataset (Fig. 6). Indeed, the genus Tmx7 was nearly absent from all V4 datasets, and the genus Leptotrichia was nearly absent from V1–V2M datasets (Fig. 6)./p> 1% abundance and compared with our data (Fig. 7). Both data sets, V1–V2M and V4, showed a very high degree of correlation with the bacterial communities in the two standards (Fig. 7B,D). In the case of GM standard, the V4 primers slightly underestimated the genera Veilonella and Limosilactobacillus and the V1–V2M primers slightly underestimated the genus Bacteroides. An analysis of the FRT community showed a slightly higher representation of the genera Bacteroides, Agathobacter and Subdoligranulum in the V4 primer data set and of Anaerostipes in the V1–V2M data set. In general, however, these results show that the V1–V2M primers give comparable data to the V4 primers./p>