機能的 ex vivo アッセイのための三日熱マラリア原虫バイオバンクの開発

Malaria Journal volume 22、記事番号: 250 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

三日熱マラリア原虫は、マラリアの原因として 2 番目に多いものの、継続的な体外培養システムの欠如により研究が依然として困難であり、機能アッセイで使用するためにサンプルごとに複数回凍結する臨床分離株のバイオバンクを確立する必要性が強調されています。寄生虫分離株を凍結保存するためのさまざまな方法が比較され、最も有望な方法が検証されました。初期および後期段階の寄生虫の濃縮と寄生虫の成熟を定量化し、アッセイ計画を容易にしました。

凍結保存プロトコルを比較するために、9 つの臨床三日熱マラリア原虫分離株を 4 つのグリセロライトベースの混合物とともに凍結しました。解凍後、KCl-Percoll濃縮後、および短期間のインビトロ培養における寄生虫の回収率をスライド顕微鏡により測定した。磁気活性化細胞選別 (MACS) による後期寄生虫の濃縮を測定しました。 -80 °C または液体窒素での寄生虫の短期および長期保存も比較されました。

4 つの凍結保存混合物のうち 1 つの混合物 (グリセロライト:血清:RBC 比率 2.5:1.5:1) では、短期間の in vitro 培養において寄生虫の回収率が向上し、寄生虫の生存率が統計的に有意 (P < 0.05) 向上しました。その後、このプロトコルを使用して寄生虫バイオバンクを作成し、それぞれ 8 つのバイアルを含む 106 の臨床分離株のコレクションが得られました。バイオバンクの品質は、47 回の解凍からいくつかの要素を測定することによって検証されました。解凍後の寄生虫血症の平均減少 (25.3%)。 KCl-Percoll 後の平均濃縮倍数 (6.65 倍)。寄生虫の平均回収率 (22.0%、30 の分離株から測定)。短期間の in vitro 培養中に、48 時間までに分離株の 60.0% で、環期寄生虫の後期段階への堅固な成熟 (栄養型、シゾントおよび生殖母細胞の 20% 以上) が観察されました。 MACS による成熟寄生虫段階の濃縮は、MACS 後の寄生虫血症の平均 30.0%、バイアルあたり平均 5.30 × 105 の寄生虫という良好な再現性を示しました。最後に、保管温度の影響をテストしたところ、-80 °C での短期 (7 日間) または長期 (7 ～ 10 年間) の保管による寄生虫の回収、濃縮、生存率への大きな影響は観察されませんでした。

ここでは、三日熱マラリア原虫臨床分離株の最適化された凍結方法が、機能アッセイで使用する寄生虫バイオバンクの生成および検証のテンプレートとして実証されます。

三日熱マラリア原虫は、地理的に最も広く分布しているマラリア原虫種であり、世界で 2 番目に高いマラリア感染源となっています。三日熱マラリア原虫の総発生率は世界全体で 2000 年の 2,050 万人から 2021 年の 490 万人まで減少しました [1]。しかし、三日熱マラリア原虫ワクチンの不足や三日熱マラリア原虫に対する耐性の増加など、この病原体を根絶する取り組みには依然として大きな障害が残っています。抗マラリア薬。

三日熱マラリア原虫の基礎生物学の研究は、連続的な体外培養システムが欠如しているため、大幅に制限されてきました[2、3、4]。この連続培養の欠如により、実験研究には三日熱マラリア原虫の臨床分離株の使用が必要となり、これらの分離株へのアクセスが限られているため、この寄生虫に関する知識の進歩が妨げられています。最近、三日熱マラリア原虫の短期間の in vitro 培養アプローチが確立され (場合によっては、凍結保存された分離株の使用を含む) [3、5、6]、単一サイクルの薬剤耐性アッセイを実行できるようになりました [3、7]。同様に、宿主網赤血球指向性 [8]、浸潤阻害抗体の効果 [9、10、11、12、13、14、15、16]、および宿主受容体変異体 [17、18] を評価するための浸潤アッセイ。熱帯熱マラリア原虫 [22、23、24] を含む感染症サンプル [19、20、21] のバイオバンキングの重要性に対する認識が高まっています。下流の実験（機能アッセイ、遺伝子発現アッセイ、ゲノミクス）のために確実に解凍できる、凍結保存された三日熱マラリア原虫分離株のバイオバンクの生成は、この分野のさらなる進歩にとって重要なリソースとなるでしょう[4]。

0.01% were included for further analysis. The blood was centrifuged at 800g for 5 min at room temperature, and serum from each isolate was separated and stored at − 80 °C for related studies. The pelleted blood was washed using phosphate buffered saline (Thermo Fisher Scientific, USA, #J61196.AP) supplemented with 0.5% (w/v) bovine serum albumin (Millipore Sigma USA, #10735086001) to separate any leftover serum components. Prior to cryopreservation, the pelleted blood was separated from leukocytes, by running the sample through CF-11 column filters prepared in the lab. Smears were prepared post processing with CF-11 to assess parasite stages and to examine the leukocyte removal. De-leukocyted samples were cryopreserved using Glycerolyte 57 (Baxter/Fenwal USA, #4A7833), added as follows: glycerolyte 57:serum:RBC ratio was 2:0:1 for mixture 1 [7], 2.5:1.5:1 for mixture 2 [35, 39], 1.66:0:1 for mixture 3 [36] and 4.15:1.5:1 for mixture 4. Samples were stored in cryovials (Fisher Scientific USA, #50001020) at − 80 °C for 24 h prior to long-term storage in liquid nitrogen cryo-tanks at − 196 °C. The serum used in the study was heat-inactivated AB + pooled plasma (Access Biologicals, USA, #A17054) collected from a non-malaria endemic region./p> 80% are infected with P. vivax [42]. The ability to collect this number of P. vivax isolates has made GMC a unique setting to develop a biobank of cryopreserved parasites for future experimentation. From 2012 to 2016, over 700 P. vivax isolates were cryopreserved using the method from Kosaisavee et al. [7], where a 2:1 ratio of the cryoprotectant glycerolyte:RBCs was used. Other ratios of glycerolyte:RBCs have been reported in the literature for cryopreservation of both P. falciparum and P. vivax (Additional file 1: Table S1). Four cryopreservation mixtures, derived from established cryopreservation protocols [7, 34, 36, 39], (Fig. 1A) that varied in the ratios of glycerolyte:RBCs (with or without the addition of serum) were tested in order to identify any differences from the established 2:1 glycerolyte:RBC ratio./p> 50%) of either immature parasites (early and late rings) or maturing parasites (trophozoites, schizonts and gametocytes) (Fig. 3B). Post enrichment, all isolates had at least 20% immature parasites. At 24 h, 57.9% (11/19) had > 20% mature stages, and a subset of 26.3% (5/19) had > 50% mature stages. These proportions did not change appreciably as by 48 h, 60% of isolates (12/20) had > 20% mature stages with 30% (6/20) having > 50% mature stages./p> 0.2% parasitaemia [3]) was demonstrated (Fig. 1C). The measured recovery of parasites using this method is still relatively low (Fig. 1E), suggesting that other improvements to this approach may be possible. Future experiments should also directly measure the recovery of reticulocytes (both uninfected and infected) as well as the effectiveness of recovery and maturation of sexual stages [49], which may be useful for future transmission studies./p>