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Scientific Reports volume 13、記事番号: 13017 (2023) この記事を引用

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種の識別は、世界貿易による外来植物害虫の侵入を防ぐために必要です。 これらの害虫の多くは研究が不足しており、迅速な分子同定法の基礎となる公的に利用可能な DNA 配列データが不足しています。 そのような系統の 1 つはクリソデイクシス属で、これには米国の貿易イニシアチブにとって潜在的に懸念される 3 種、C. includens、C. chalcites、および C. eriosoma が含まれます。 ここでは、進化の関係を明らかにし、リアルタイム PCR 同定技術を開発するために、ロングリード シーケンスを使用して堅牢な 45S rDNA プロファイルを生成する方法について説明します。 このような識別ツールは、従来の形態学的識別方法が不十分な場合に、検疫対象となるクリソデイクシス種を迅速に識別するのに役立ちます。 このような分子法は、各標本の識別に費やす時間を大幅に短縮し、eDNA の検出を可能にし、スループットを大幅に向上させ、検出の確率を高めます。 ここで紹介する方法は一般に、分子診断アッセイを必要とする十分に研究されていない鱗翅目分類群に適用可能であり、プライマーを調整またはテストすることで、ベンチトップ設定での rDNA プロファイルの開発が有用であることが判明するあらゆるグループに適用できます。

人間による種 (特に植物や昆虫) の移動がかつてないほどの速さで起こっているグローバル化した世界では、種の診断の重要性がますます高まっています1,2。 人の移動が増加し、食用作物、切り花、木材梱包材などの農産物の世界的な輸送が増加しているため、侵入害虫種の侵入と定着を制限するには、関連する昆虫を迅速に検出して特定する能力が最も重要です3,4。 米国では、害虫の存在を検査するために、入国港での貨物や商品の検査、および国内の外来害虫の調査が行われています。 これらの標本の識別は難しい場合があり、多くの場合、微生物が発見された宿主と出荷元の正確な記録に依存しますが、どちらも複数の場所を経由する積み替えにより複雑になる可能性があります5。 多くの場合、捕らえられた害虫は、その科、亜科、または属でしか識別できません。 これは鱗翅目に特に当てはまり、ほとんど独占的に幼虫の段階で捕らえられます。

国内調査で捕獲された昆虫の識別も困難です。フェロモンルアーへの相互誘引により、単一のトラップで数十、数百の同様の非対象昆虫が捕獲される可能性があるためです。 確立される前（すなわち、誘導期6）に侵入種を検出するには、潜在的な標的を迅速に同定することが望ましいが、そのためには多くの場合、各標本を解剖するか、シトクロムcオキシダーゼ1（CO1）DNAバーコーディングなどの分子的アプローチが必要となる7。 どちらのアプローチも時間がかかり、これまで記載されていない種、特性が十分に解明されていない種、または公的に入手可能な配列データが欠如している種に対しては信頼できない可能性があります。 侵入種の検出の可能性を高めるために、一般的に捕獲され、侵入する可能性のある害虫種の一部に対して、迅速またはハイスループットの分子アッセイが開発されています（例8、9、10、11）。 ハイスループットの分子同定技術は、検出の確率を高めるだけでなく、特に多重化アッセイの場合、同定を完了するのに必要な時間とコストを劇的に削減します12、13。 侵入の可能性が高い一部の種も研究が不足しており、系統学的配置や姉妹種の説明、種内の系統地理的変異、公的に入手可能な配列データなどの基本情報が不足しています7,14。

CO1 配列の大規模なデータベースは多くの種 (BOLD15、GenBank16) で利用できますが、この領域は、AT 含量が高く、種間変動が少ないため、リアルタイム PCR などの DNA 配列ベースの技術の開発にはあまり適していない可能性があります。 /または急速な進化と遺伝的浮動に起因する高い種内変動17。 このような状況では、多くの場合、45S リボソーム RNA (rRNA) の領域を使用して種の同定を確実に行うことができます。 配列決定される最初の核酸の中で、45S rRNA はゲノム中に非常に豊富に存在し、長さが比較的短い18。 rRNA ユニットは、外部転写スペーサー (ETS)、18S rRNA、内部転写スペーサー (ITS) 1、5.8S rRNA、ITS2、および 28S rRNA で構成される構造的に保存されたタンデムリピートで構成されています19。 rRNA のこれらの特性、およびコード領域での配列の保存と、基礎となるリボソーム DNA (rDNA) の非コード ITS 領域での高い進化率により、この遺伝子座を系統樹全体にわたる系統研究に使用するようになりました。人生20、21。 これらの系統学的研究から、大量の rDNA 配列データが公的に利用可能になり、研究者はそこから迅速な種の同定方法を開発しました。 これらの遺伝子座は、ITS 領域が種内で比較的保存されており、種間での多様性が高く (点突然変異とインデルの両方を含む)、ゲノム内に高いコピー数で存在するため、このような分子アッセイに理想的です。 これにより、それらはプローブベースの PCR アッセイを開発するための理想的な候補となり 8、22、23、分解された DNA や複雑な環境サンプルからでもこれらの配列の増幅が可能になります 24、25。 18S、28S、および 5.8S rRNA コード配列は高度に保存されているため、問題の種の rDNA 配列データが入手できない場合でも、この領域全体を増幅するユニバーサル プライマーの開発は可能です。 しかし、単一ゲノム内のコピー数が多いため、個体内のコピー間にヌクレオチドの違いが存在します。 これらの個体内変異はリボタイプと考えられており 26,27 、種を同定するための信頼できる DNA ベースの技術を開発する際には、このようなリボタイプ変異は避けるべきであるが、リボタイプ変異の特徴付けが完了することはほとんどない。 したがって、ハイスループットシークエンシング法の使用は、リボタイプの多様性を特徴付けたり、リピート間に存在する固定変異と一時的変異を区別したりするのに役立ちます。