複数のサルモネラ血清型に対するファージカクテル開発の有効性とそのバイオフィルム制御活性の比較分析

Scientific Reports volume 13、記事番号: 13054 (2023) この記事を引用

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10 オルトメトリック

メトリクスの詳細

食中毒は、世界の食品産業において大きな課題であり、特に多剤耐性 (MDR) 細菌によって引き起こされる病気です。 MDR 株に加えて、バイオフィルムを形成する可能性のある細菌は治療効果を低下させ、細菌制御に重大な脅威をもたらします。バクテリオファージは、細菌に感染して殺すウイルスであり、人間の医療と動物生産の両方において、MDR 細菌と戦うための有望な代替手段と考えられています。複数のファージを含むファージカクテルは、宿主範囲を広げ、ファージ耐性の発現を予防または遅延させるために一般的に使用されます。バクテリオファージの溶解活性を評価するために利用できる技術やプロトコルは数多くありますが、最も一般的に使用される方法は、スポットテストアッセイ、プレーティング効率 (EOP)、および液体培養での感染アッセイです。しかし、ファージの宿主範囲とカクテルの組成を正確に決定するために、どの分析を採用すべきか、またそれらの間で考えられる差異については、現在標準化されていません。スポットテストアッセイを使用した予備選択により、多数の血清型の 36 個のサルモネラ菌分離株のパネルに対するその後の評価用の 4 つのファージが得られました。 EOP と液体培養における感染アッセイを比較すると、EOP がファージの溶解活性を過小評価し、ファージカクテルの開発に直接影響を与える可能性があることが明らかになりました。さらに、EOPによれば、選択された4つのファージを含むファージカクテルは、ファージに対する低い感受性を示す分離株を含む分離株の66％（23/35）によって形成されたバイオフィルムを制御または除去することができた。ファージはゲノム的に特徴づけられ、抗生物質耐性、病原性因子、またはインテグラーゼに関連する遺伝子が存在しないことが明らかになりました。共焦点レーザー走査型顕微鏡分析によると、液体培養および96ウェルプレートバイオフィルム生存率アッセイではファージに対する高い感受性を示したが、EOPの値が低かったあるサルモネラ菌分離株のバイオフィルム成熟が、ファージによって阻害され制御されていることが判明した。カクテル。これらの観察は、ファージが、EOP 値が低いにもかかわらず、その成長および成熟プロセス全体を通じてサルモネラ菌バイオフィルムを制御および除去できることを示しています。さらに、液体培養での感染アッセイを使用すると、カクテル設計のためのファージ相互作用のより正確な研究を、時間をかけずに簡単に行うことができます。したがって、さまざまな条件下で宿主範囲とバクテリオファージの溶解活性を包括的に評価するための戦略と技術を統合することで、ファージカクテルの抗菌能力をより正確に実証できます。

サルモネラ属菌これらは、公衆衛生上の脅威として世界中で認識されている、頻繁に使用されるヒト病原体です1。食中毒病原体の中で、サルモネラ菌は死因の第 3 位にランクされているため、経済的にも大きな負担となります。食中毒の世界的負担に関する世界保健機関の最新報告書では、世界中でサルモネラ菌によって引き起こされる年間8,800万件の症例のうち、12万3,000件が死亡し、合計22万2,000年の寿命が障害を抱えながら生きていると推定されています1。

サルモネラ菌の主な特徴の 1 つは、過酷な環境でのサルモネラ菌の生存を可能にしているのは、表面に関連した複雑な群集（バイオフィルム）の形成であり、ブラジルで屠殺された鶏から分離されたサルモネラ菌株の50％以上がサルモネラ菌の能力を示しているため、特に養鶏場ではその増殖を制御することが困難である。バイオフィルムを形成します2、3、4、5。ポリマーマトリックス内の細胞の組織化により、バイオフィルムは殺生物剤に対する耐性を高めます 6,7。これにより、殺生物剤の浸透が減少し、細菌が食品加工環境で長期間存続することになります 5,8。

したがって、多剤耐性微生物の出現による抗生物質の使用を減らすことを目的として、家禽生産におけるサルモネラ菌を制御する戦略を開発することが非常に重要です9,10。このシナリオでは、バクテリオファージがバイオフィルムを阻害または破壊する薬剤として関心を集めています 11、12、13。

0.001 and < 0.1, and “Inefficient” for ratios ≤ 0.001./p> 0.5, “Medium” for 0.2 ≤ v1 ≤ 0.5, “Low” for 0.001 ≤ v1 < 0.2, and “Inefficient” for v1 < 0.001./p> 107 CFU/mL) of host strain, we assume that 100% phage adsorption has occurred soon following phage addition25./p>

0.05, two-way ANOVA and post hoc Tukey’s multiple comparison test) was observed for phage treated compared to 48 h biofilm control, indicating that the phages in the cocktail did not increase biofilms' growth for any tested isolates./p> 70%), they are from different species (< 95%). The intergenomic similarity between phB7 and phC17 is 86.5%, which also classifies them as different species in the same genus (Fig. 7b). This is reaffirmed by phylogeny analysis by VICTOR34, which grouped the four phages within the same family and genus. However, VICTOR results differentiated all the phages in different species, including phA11 and phC11, although their phylogenetic distance is low (Fig. 7c). This difference between VIRIDIC and VICTOR results regarding species level can be explained by the difference in the calculations and species thresholds used for each one. All four phages were classified in the class Caudoviricetes, family Demerecviridae, subfamily Markadamsvirinae, and genus Tequintavirus./p> 90%) with only five different phages, infecting Salmonella enterica, Shigella sp., and Escherichia coli. For phages phC17/phB7 endolysin genes, BLASTn showed high similarity (> 90%) with seventy-five different phages, infecting Salmonella enterica, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae./p> 0.05, two-way ANOVA and post hoc Tukey’s multiple comparison test) increase the growth of the biofilm for any of the tested isolates in the analysis, reinforcing the high lytic activity of the selected phages. This is of special interest since specific phages modulate several properties of their host, including the possibility of increasing biofilm production45. A more detailed analysis of the interaction of the phages with the Salmonella biofilm can be seen in the CLSM images. At 24 h of incubation, the biofilm was not mature, but initial cell clusters can be observed with high thickness. A phage cocktail applied at this stage could stop the maturation of the biofilm by reducing the cell density and preventing cell clumping after an additional 24 h of incubation since the bacterial cells were not eradicated but are dispersed, which can be inferred as a certain level of phage resistant mutant cells. The elimination of bacteria from biofilm structure by phages shows differences in effects regarding the number of phages (individual phage or phage cocktail)46,47,48, the Salmonella serovars, the stage of biofilm maturation, and the composition of biofilm (mixed or single species)49. Combining phage therapy with alternative treatments or antibiotics can be an excellent strategy to eliminate resistant mutant cells and eradicate biofilms. A recent study by Duarte et al.50 described the synergistic activity of a single phage and a phage-derived lytic protein against staphylococcal biofilms, demonstrating that combining phages with lytic proteins might help curtail the development of phage resistance. The combination of phage with antibiotics was also effective against biofilms, as demonstrated by Dickey and Perrot51, showing the prevention of antibacterial-resistant bacteria, mainly when phage was used first and antibiotic second. However, antibiotic/phage combination must be carefully studied once it could increase the distribution of antibiotic resistance genes or have an antagonistic effect, especially with drugs that act inhibiting nucleic acid or protein synthesis52./p> 0.001 and < 0.1, and “Inefficient” for ratios ≤ 0.00122. A Heatmap comparing EOP values was plotted using GraphPad Prism v. 9.1.1 (GraphPad Software)./p> 0.5, “Medium” for 0.2 ≤ v1 ≤ 0.5, “Low” for 0.001 ≤ v1 < 0.2, and “Inefficient” for v1 < 0.001. A Heatmap comparing the v1 score for individual phages and the cocktail was plotted using GraphPad Prism v. 9.1.1 (GraphPad Software). R v. 4.2.2 was used to plot the comparison of EOP and v1 in a dotplot graph./p>

4 × ODc = Strong biofilm producer./p>