形質細胞の選択的濃縮 - 浙江ホットプロダクツ株式会社

Communications Biology volume 6、記事番号: 885 (2023) この記事を引用

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3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細胞外小胞 (EV) は、細胞外低分子 RNA 輸送の重要なメディエーターであることが示されています。しかし、ヒト生体液中の無細胞メッセンジャー RNA (cf-mRNA) のキャリアおよびそれらと癌との関連については、依然として十分に理解されていません。ここでは、肺がん、肝臓がん、多発性骨髄腫、および健康なドナーからのサイズ分画血漿のトランスクリプトーム分析を実行しました。形態およびサイズ分布分析により、他の可溶性血漿タンパク質画分から大きな粒子と中程度の粒子がうまく分離されたことが示されました。私たちは、技術的な変動を制御し、それぞれに含まれる cf-mRNA 量の本質的な大幅な差異を正規化するための RNA スパイクインの実装により、粒子およびタンパク質が豊富な部分集団から極微量の cf-mRNA を精製および配列する戦略を開発しました。血漿画分。我々は、RNase が豊富な環境において、cf-mRNA の大部分が EV 内で濃縮および保護されており、顕著な安定性を示していることを発見しました。我々は、各粒子およびタンパク質が豊富な部分集団におけるがん関連 cf-mRNA の特異的な濃縮パターンを観察しました。 EVに富む分化遺伝子は、それぞれ肺がん、肝臓がん、多発性骨髄腫における免疫系、肝機能、有毒物質制御などの特定の生物学的経路と関連していた。私たちの結果は、EV 亜集団の複雑さを分析することでその生物学的重要性が明らかになり、有望なリキッドバイオプシーアプローチが提供されることを示唆しています。

細胞外 RNA (exRNA) としても知られる無細胞 RNA (cfRNA) は、脳脊髄液 (CSF)、唾液、血清、尿、血漿などの多くの体液に存在します 1、2、3。最も一般的に報告されている cfRNA バイオタイプは、microRNA (miRNA)、トランスファー RNA (tRNA) フラグメント、および piwi 相互作用 RNA (piRNA) を含む低分子非コード RNA (ncRNA) です。研究では、生体液中にメッセンジャー RNA (mRNA) と長い非コード RNA (lncRNA) も発見されています 5、6、7、8、9。 cfRNA は、血液中の RNase レベルが高いため、無細胞 DNA よりも脆弱で存在量が少ないと考えられてきました 10 が、血液中に存在する miRNA は著しく安定していることがいくつかの研究で実証されています 11,12。多くの cfRNA 研究は、体液中での cf-miRNA の安定性を理由に、cf-miRNA の特性評価に焦点を当てています 11,12。しかし、我々および他の研究者は、cf-mRNA が非侵襲性バイオマーカーとして利用できる安定した疾患特異的シグネチャも保持できることを最近実証しました 8,13,14,15,16,17,18。

cfRNA は、細胞外小胞 (EV)、リボ核タンパク質、さらにカイロミクロン、超低密度リポタンパク質 (VLDL)、低密度リポタンパク質 (LDL)、高密度リポタンパク質 (HDL) などのリポタンパク質を含むキャリアの複数のサブクラスと関連しています。さまざまなキャリアに梱包される RNA カーゴの種類と割合は、生体液の種類、分析前要因、生理学的または病理学的状態に依存する可能性があります。 NIH 細胞外 RNA (exRNA) コミュニケーションコンソーシアムは、19 件の研究にわたる計算デコンボリューションを通じて miRNA の主要キャリアを広範囲に比較する exRNA アトラスリソースを作成しました 2,19。これらの比較統計研究により、miRNA カーゴタイプのうち 5 つが既知の小胞キャリアおよび非小胞キャリアと関連していることが特定されました 2。これらの研究は、EVがRNA輸送の重要なメディエーターであることを示唆していますが、他の研究では、RNA結合タンパク質複合体がヒト血漿中の小胞とは独立してmiRNAを運ぶことができることを示しています12、13、20。 RNase に富む血漿中で安定性を提供する cf-mRNA キャリアを同定すると、基本的な生物学と機能が明らかになるだけでなく、臨床応用のためのキャリア固有のバイオマーカーの潜在的な異なる形態が明らかになる可能性があります。細胞培養ならし培地では、cf-mRNA が EV と関連していることが示されました 13,20。しかし、ヒト生体液中でどのキャリアが cf-mRNA と結合するかは、まだ十分に特徴付けられていません 1,21。

0.05; *P < 0.05, **P < 0.01, and ****P < 0.0001) with three technical replicates of FR14 and FR58 of plasma pooled from three healthy individuals. c A box plot of negative raw cycle threshold (- raw ct) of individual genes with RNase and/or detergent treatment using qRT-PCR. RNA isolated from combined FR14 and FR58 using three healthy individuals and three technical replicates of control RNA were treated with RNase and/or detergent. Data are analyzed using RStudio and reported as means ± SD of three independent samples./p> 1) between each cancer type and healthy controls within a specific fraction (Fig. 5a). We used permutation tests to evaluate the statistical significance of DE analysis (Supplementary Fig. 9). To analyze the enrichment patterns, we calculated fold change of these DE genes identified between each cancer type compared with controls within each fraction and visualized in a heatmap (Fig. 5a). We found that, compared to healthy controls, the fractionated plasma of lung cancer patients had significantly upregulated mRNAs, specifically 136, 199, 462, 151, 105, and 7 within medium EVs, small EVs, non-EV particles, early-, middle-, and late-eluting protein fractions respectively (Supplementary Fig. 10a). Intriguingly, the heatmap visualization of fold changes in cancer patients compared with healthy controls displayed distinct enrichment patterns of lung cancer-differentiating cf-mRNA, specific to EV and protein subpopulations (Fig. 5b). The majority of DE genes are enriched in specific EV and protein fractions with very few DE mRNA being shared between fractions (Supplementary Fig. 10). To assess the potential roles of these selectively enriched cancer distinguishing gene sets in each plasma fraction, we performed pathway enrichment analysis using g:Profiler curated on gene ontology and Reactome databases, Cytoscape, and EnrichmentMap (Fig. 5a). Differentiating genes enriched in FR14 (medium EVs) from lung cancer were associated with both immune system and metabolic process (Fig. 5c), while DE genes enriched in FR912 (non-EV particles fraction) were implicated in the immune system and myeloid leukocyte mediated response (Fig. 5c). Differentiating genes enriched in FR1619 (early-eluting protein) from lung cancer were enriched in protein localization nucleus, steroid hormone corticosteroid, and defense virus symbiont, while DE genes enriched in FR3033 (late-eluting protein) were enriched in sphingolipid metabolism (Fig. 5c)./p> 1). After DE genes were identified, log2 fold change (log2FC) was calculated by subtracting log2 counts of cancer from individual biological replicates to the mean of corresponding healthy fractions. Gene lists were organized by fraction. DE genes were identified for selective packaging heatmap analysis. Using the DE genes identified from each fraction, g:Profiler was performed on gene ontology biological properties and reactome for functional enrichment analysis. Pathway enrichment analysis was performed using Cytoscape and EnrichmentMap. b Heatmap of gene expression in lung cancer relative to healthy across fractions. c Enrichment map for lung cancer DE genes found in individual fractions using Gene Ontology (Biological properties) and Reactome with FR14, FR912, FR1619, and FR3033 color coded by red, green, purple and yellow, respectively. Cluster represents (i) steroid hormone corticosteroid, (ii) Cellular response chemical, (iii) defense virus symbiont, (iv) regulation myeloid cell, (v) negative regulation response, (vi) toll cell receptor 4, (vii) g1 specific transcription, and (viii) hemidesmosome assembly. Cluster of nodes were automatically labeled using the AutoAnnotate from Cytoscape./p> 1) per cancer type compared to healthy controls within each fraction. Intriguingly, our heatmap visualization of enrichment patterns revealed distinct multiple cancer differentiating cf-mRNA specific to EV and protein fractions (Fig. 6a). Although there is a slight increase in expression of cf-mRNA between small EV-associated lung cancer DE genes with multiple myeloma and liver cancer, the majority of these genes were not differentially expressed within multiple myeloma and liver cancer. In addition, we performed functional enrichment analyses on these combined gene sets and found the majority of biological function related terms were unique for each cancer type and fraction with minimal overlap on humoral response antimicrobial from both FR14 of lung cancer and FR2326 of multiple myeloma (Fig. 6b). These overall selective enrichment patterns associated with multiple cancers within EV subpopulations and protein fractions suggests that distinct cf-mRNA are packaged into different types of extracellular carriers in cancer./p>

1. To test the significance of the differential expression results for each pairwise comparison of cancer to healthy control per fraction, we performed a permutation test in which differential expression analysis between two groups of randomized samples was compared using the DESeq2 package. For each pair, 1000 permutations of random shuffling were performed and the number of differentiating genes with padj < 0.05 were documented for building a histogram, and compared to the number of significant genes (padj < 0.05) for the group with correct labeling./p> 1 from DESeq2 (v1.22.2). For DegPattern analysis from R package DEGreport (v1.18.1), a total of 11,577 differentially expressed genes determined by one-way ANOVA test across plasma fractions with false discovery rate less than 0.05 were used./p>